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1492-24-6 / 谷氨酸变位酶与天冬氨酸-β-脱羧酶偶联催化L-谷氨酸合成L-2-氨基丁酸

L-2-氨基丁酸(L-ABA)是一种重要的非天然氨基酸,是制备抗癫痫药物和抗结核药物的关键手性前体,一般由α-卤酸和丁酮酸还原化学合成L-ABA。由于化学试剂毒性大,产物分离纯化困难,化学合成L-ABA的方法是环境不友好的。丰富的L-谷氨酸可以通过直接的γ-脱羧反应为L-ABA的生产提供来源。然而,L-谷氨酸的γ-脱羧反应尚未见报道。为了达到这一目标,近期,江南大学周哲敏课题组设计了一条由两步组成的生物合成路线。谷氨酸通过谷氨酸变位酶(GM)转化为3-甲基天冬氨酸,然后由L-天冬氨酸-β-脱羧酶(Asd)进行β-脱羧反应。该路线仅包括异构化和脱羧反应,不需要任何其他氨基供体或辅因子再生;此外,β-脱羧反应不可逆,不需要控制反应平衡;而且L-谷氨酸比L-苏氨酸经济得多。

谷氨酸变位酶与天冬氨酸-β-脱羧酶偶联催化L-谷氨酸合成L-2-氨基丁酸

谷氨酸变位酶与天冬氨酸-β-脱羧酶偶联催化L-谷氨酸合成L-2-氨基丁酸

图片来源:ACS Catal.

首先对纯化的GM进行了表征,在37℃时,催化L-glutamate转化为3-甲基天冬氨酸的比活力为7.5u/mg。同时,选择了一种来源于抗辐射不动杆菌的、对L-天冬氨酸具有高β-脱羧活性的Asd(ArAsd)作为促进3-甲基天冬氨酸转化为L-ABA的第二种酶。然而,由于底物的特异性,没有检测到WT-ArAsd对3-甲基天冬氨酸的活性,这也是氨基酸脱羧酶的一个显著特征。为了提高3-甲基天冬氨酸β-脱羧活性,在酶结构的基础上进行了对ArAsd分子改造。底物进入活性位点的通道有两个重要的氨基酸残基S486和K18,将K18变成A18后,在结构上通道口变大。

谷氨酸变位酶与天冬氨酸-β-脱羧酶偶联催化L-谷氨酸合成L-2-氨基丁酸

图片来源:ACSCatal.

为了进一步提高ArAsd对3-甲基天冬氨酸的活性,考虑对催化口袋进行进化。Asd属于I型PLP酶家族,将L-天冬氨酸转化为L-丙氨酸和CO2,PLP共价结合在催化口袋的Lys315上,ArAsd中对应的残基为Lys314。因此,首先考虑PLP 5A范围内的残基。为了确定调控底物特异性的关键残基,对这些残基进行了丙氨酸扫描诱变,结果是双突变K18A/V287I的酶活最高。

谷氨酸变位酶与天冬氨酸-β-脱羧酶偶联催化L-谷氨酸合成L-2-氨基丁酸

图片来源:ACSCatal.

最终,以谷氨酸为唯一底物,通过GM与Asd的偶联反应,构建了合成L-2-氨基丁酸的级联反应。根据GM和K18A/V287I的特性,反应在pH 6.6和37℃下进行,培养4h后,L-谷氨酸(4.5mm)转化率为90%,检测到L-ABA的含量为4.45mM,L-谷氨酸转化为L-ABA的转化率高达98.9%。

谷氨酸变位酶与天冬氨酸-β-脱羧酶偶联催化L-谷氨酸合成L-2-氨基丁酸

图片来源:ACSCatal.

参考文献:Enzymatic Biosynthesis of L‑2-Aminobutyric Acid by Glutamate Mutase Coupled with L‑Aspartate-β-decarboxylase Using L‑Glutamate as the Sole Substrate

ACS Catal.

DOI:10.1021/acscatal.0c04141