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9054-89-1 / 超氧化物歧化酶的活性测定方法

背景及概述[1][2]

活性氧包括超氧阴离子、羟基自由基、过氧化氢、单线态氧等,这些粒子均十分微小。由于存在未配对的自由电子,活性氧的化学性质十分活跃。活性氧往往是生物生化过程中的一种副产品,当其过量时,机体内的活性氧会对细胞和基因结构造成损坏,引发多种疾病,如细胞毒性、衰老、癌症等。超氧阴离子是其他几种活性氧的源头,超氧化物歧化酶能够清除机体中过量的超氧阴离子,它能够催化超氧阴离子发生歧化反应,产生氧气和过氧化氢,具有抗炎、抗病毒、抗衰老等作用。

超氧化物歧化酶的活性测定方法

活性测定方法[1]

现有的测定超氧化物歧化酶活性的方法主要是黄嘌呤氧化酶-NBT法、 肾上腺素自氧化法、Marklund邻苯三酚法、化学发光法等。但是黄嘌 呤氧化酶-NBT法中,NBT产物甲臜水溶性差,需要加入助溶剂增加水溶 性,因此此法应用有一定的限制。肾上腺素自氧化法和Marklund邻苯 三酚法是根据肾上腺素和邻苯三酚在碱性条件下自氧化,产生超氧阴离子和有色物质,根据有色物质的含量变化测定超氧化物歧化酶活性 ,但是有色物质不稳定,存在时间短,因此测定有误差,重现性较差 。化学发光法是通过使用化学发光剂使体系产生化学发光,间接的检 测超氧阴离子的方法,该方法由于发光时间短暂,测定困难并易产生误差,重现性较差。

CN201210341599.6提供一种测定超氧化物歧化酶活性的方法,该方法包括以下步骤:

步骤a、超氧阴离子产生体系缓冲溶液的配制

配制浓度为50毫摩尔/升的碳酸氢铵缓冲溶液,调节pH值为9.3;

步骤b、标准品的配制

用步骤a中的碳酸氢铵缓冲溶液将标准品配成浓度为50微摩尔/升的标 准溶液,所述的标准品为2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2'4-二磺基苯 )-2H-四氮唑钠盐,能和超氧阴离子反应产生水溶性甲臜染料;

步骤c、对照品、样品和空白样品的制备

对照品的制备:反应总体积160微升,先加入40微升2毫摩尔/升乙二胺 四乙酸二钠盐,加入40微升生理盐水,加入40微升50微摩尔/升的2-( 4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2'4-二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐,最后加入40微升1毫摩尔/升邻苯三酚水溶液,37℃反应12分钟后,作为对照品,供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定;

样品的制备:反应总体积160微升,先加入40微升2毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐,加入40微升3.12毫克/升超氧化物歧化酶标准品溶液(生理盐水溶解的),加入40微升50微摩尔/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2'4-二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐,最后加入40微升1毫摩尔/升邻苯三酚水溶液,37℃反应12分钟后,作为样品,供内置紫外可见分光 光度计的酶标仪测定;

空白样品的制备:反应总体积160微升,先加入40微升2毫摩尔/升乙二 胺四乙酸二钠盐,加入40微升3.12毫克/升超氧化物歧化酶标准品溶液 (生理盐水溶 解的),加入40微升50微摩尔/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2' 4-二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐,最后加入40微升水溶液,37℃反应12分钟后,作为空白样品,供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定;

步骤d、对照品、样品和空白样品的检测

对照品检测:以96孔板为载体,在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中进行测定,设定紫外-可见检测波长为450纳米,对步骤c制备的对照品进行测定,得到对照品的吸光度值A对照品;

样品检测:以96孔板为载体,在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中 进行测定,设定紫外-可见检测波长为450纳米,对步骤c配制的样品进行测定,得到样品的吸光度值A样品;

空白样品检测:以96孔板为载体,在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中进行测定,设定紫外-可见检测波长为450纳米,对步骤c配制的空白样品进行测定,得到空白样品的吸光度值A空白样品;

步骤e、超氧化物歧化酶的活性的计算

超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率按照以下公式计算:

I样品=[A对照品-(A样品-A空白样品)]/A对照品×100%

式中,I为超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率;

A对照品为对照品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2'4-二磺基苯)-2H-四氮 唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值,无量纲;

A样品为样品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2'4-二磺基苯)-2H-四氮唑 钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值,无量纲;

A空白样品为空白样品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2'4-二磺基苯)-2H-四 氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值,无量纲;

超氧化物歧化酶活性的计算公式如下:

超氧化物歧化酶活性=I/(1–I)

根据测得的对照品、样品和空白样品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5- (2'4-二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值A对照品、A样品和A空白样品,经计算得到0.78毫克/升超氧化物歧化酶标准品对超氧阴离子的清除率为42%,进而得出超氧化物歧化酶标准品的活性为5.8U/μg。

分离提纯[2]

一种利用结晶法分离提纯超氧化物歧化酶的方法,其特征在于步骤如下:

步骤1:利用超声破碎仪将细菌发酵培养液破碎后,离心取上清,用盐酸调节蛋白 质溶液pH值至酸性,0℃-4℃静置1h-3h后,离心取上清,超滤浓缩后得到蛋白质溶液;

步骤2:将沉淀剂溶解在0.1-5mM,pH值为3.0-5.5的柠檬酸溶液中,与蛋白质溶液 按1:1体积比混合后,加入10-200μL籽晶,置于控温箱中,在4℃-20℃中搅拌结晶;所述沉淀 剂为PEG8000,浓度为20-80mg/mL;

步骤3:将结晶完成后的溶液离心后取沉淀,所得沉淀即为超氧化物歧化酶晶体混合物;

步骤4:加入超氧化物歧化酶晶体清洗溶液,缓慢搅拌混匀后,离心弃上清,重复该 过程多次以彻底清洗晶体,得到超氧化物歧化酶晶体;所述晶体清洗溶液为20-100mg/mL的 PEG8000溶液;

步骤5:将所得晶体冻干,得到白色粉末状超氧化物歧化酶成品,或不冻干,直接作为晶体制剂应用。

对于步骤4得到的超氧化物歧化酶晶体溶解后的溶液取代步骤2的蛋白质溶液,采用与步骤2相同的结晶条件重复结晶多次,使所制得的超氧化物歧化酶晶体纯度更高。

主要参考资料

[1] CN201210341599.6 一种测定超氧化物歧化酶活性的方法

[2] [中国发明] CN201810289241.0 一种利用结晶法分离提纯超氧化物歧化酶的方法