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纪宁生物星状病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒产品及特点

纪宁生物星状病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒产品及特点
星状病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

星状病毒(Astrovirus,AV) 可以引起幼小动物产生腹泻症状,包括哺乳动物属和禽类属。哺乳动物属根据宿主的不同分为人星状病毒、猫星状病毒、猪星状病毒、绵羊星状病毒以及貂星状病毒;禽类星状病毒包括火鸡星状病毒、鸟肾炎病毒。目前使用的疫苗仅有用于预防鸡星状病毒疾病,为灭活苗。人类星状病毒疾病的疫苗至今没有研制成功,因此灵敏快捷的诊断产品具有重要的意义。本产品基于PCR原理开发。
1. 一站式,用于不需要单独准备每种成分,包括引物和对照。
2. 根据星状病毒的保守基因序列设计的引物,具有良好的特异性。
3. 基于染料法 qRT-PCR 检测,灵敏度比常规 RT-PCR 高 10-100 倍,可以达到至少 1000 拷贝/反应。
4. 使用一管式 qRT-PCR 技术,RT 和 PCR 两步在一个试管内完成,不需要中间转移样品,降低了操作误差和可能的污染。
5. 本产品足够 50 次 30μL 体系的 RT-PCR。
运输及保存:
低温运输、-20℃保存,有效期一年。
阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供 DNA 片段作为阳性对照。
自备试剂:
样品 RNA。
使用方法:
一、稀释阳性对照:
以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例,由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。
1. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液,最好用带芯枪头,下同)。
2. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供),充分震荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
3. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
4. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备:
5. 如果有 N 个样品,必须设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第 4 号(浓度为 1×10E4 拷贝/μL,10μL 相当于 1 万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样,样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。
6. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。
三、设置 RT-PCR 反应(20 μL 体系,在样品制备室进行):
7. 如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照,6 个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),1 个用于 PCR 阳性对照(用第 4 号阳性对照稀释液做模板)。下面只描述定量分析的步骤,定性分析只是把 6 个标曲反应缩减成 1 个,其余不变。
8. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加):
注: 需使用 ROX 染料 I 的机型:ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。
需使用 ROX 染料 II 的机型:ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的 Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。
不需要使用ROX 的机型:Thermal Cycle Dice Real Time System,LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。
9. 上机后按下面参数进行 RT-PCR(参数可能会因仪器不同而需优化)。
四、数据处理:
10. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA浓度的 log 值,再推算出其浓度。
11. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性,如果小于 40,则为阳性。上海纪宁生物一直致力于为广大高校、科研院所和企事业单位提供的星状病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒科研试剂和完善的技术服务,满足生物化学、分子生物学、细胞生物学、免疫学等生物科技实验需求。
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