原代细胞是从人或动物供体组织直接分离，经机械/酶消化成单细胞或混合细胞群，在体外模拟生理环境（无菌、37℃、5%CO₂、定制培养基）中短期存活并有限增殖。需通过差速贴壁或抑制剂纯化目标细胞，广泛应用于药物测试、分化研究及病毒宿主机制分析。
原代细胞培养的注意事项
（1）无菌操作：无菌操作是原代细胞培养成功的基石。细菌与霉菌污染占失败案例的80%以上，需以预防为核心：操作前紫外消毒≥30分钟+器械乙醇浸泡；取材后立即双抗漂洗；培养基添加抗生素仅作临时防护（如0.5%Primocin）。污染后难以彻底清除，因细菌生物膜、支原体穿透性及霉菌孢子抗性均可能导致细胞报废，需废弃污染样本并彻底环境消杀。
（2）培养基：培养基需满足细胞营养、渗透压（哺乳类260–320mOsm/kg）及pH（7.2–7.4）等生存条件。因物种与组织差异（如神经元用Neurobasal+B27，昆虫细胞用MGM-448），需通过预实验筛选配方：测试细胞增殖速度、贴壁率及形态稳定性，并验证血清批次适用性。添加生长因子（如bFGF）或抑制剂（如BrdU）时，需定制浓度；无血清培养基适用于特定分泌实验。
（3）小牛血清：胎牛血清（或优质新生牛血清）对维持细胞存活及增殖至关重要，其白蛋白、转铁蛋白和生长因子是核心功能成分。需预筛选至少3个批次：通过细胞增殖率（CCK-8法）、贴壁率及无污染检测（如支原体PCR）综合评估；选定批次后应分装冻存、避免反复冻融，并全程用于同一项目。若需切换批次，需交叉培养验证细胞适应性72小时。
（4）胶原酶溶液：胶原酶溶液需新鲜配制，因冻存（含-80℃）会导致酶空间结构解折叠，活性不可逆衰减。若需保存，应分装避光存于-80℃且≤2周。消化时需实时监控组织状态，延长消化时间将加剧细胞膜损伤与代谢紊乱。
（5）L-谷氨酰胺：几乎所有细胞对其有高需求，是合成核酸/蛋白质的关键底物及能量来源，缺乏会导致生长停滞甚至死亡。但其降解产物氨（NH₃）具有强毒性（>2mmol/L即抑制代谢），建议：
单独分装后-20℃冻存，避免反复冻融；
使用前临时加入培养基；
4℃保存超过7天需补加全量，若培养基变黄（pH>7.6）则废弃换新液；
对氨敏感细胞（如神经元），优先选用丙氨酰-谷氨酰胺替代品。
（6）静置培养：消化分离后的初期（24-72小时）需保持培养环境稳定，避免物理扰动。但需每日远程监测培养基颜色（pH）、CO₂浓度及温度。若培养基变黄或出现悬浮颗粒，应立即终止静置；对包被依赖性细胞（如神经元），静置前需进行基质预涂布。
（7）消化时间：通常消化至肉眼可见微小组织颗粒即可，因为此时组织颗粒已松散，稍加吹打即可形成细胞团或单个细胞，过长的消化时间往往导致细胞损伤加重，细胞培养成活率降低。
（8）生长因子：经消化、贴壁等常规处理后，原代细胞培养仍需针对性添加生长因子。例如胰岛素可增强代谢底物摄取；EGF、bFGF等能促进有丝分裂，但成本较高。特殊类型细胞（如神经元、干细胞）还需组合特定因子（如VEGF、KGF）以维持功能。
原代细胞培养的成功，依赖于无菌操作、培养基定制、血清筛选等环节的精准协同调控。未来需推动无血清培养基降低批次差异，结合自动化监测优化消化终点。其核心价值在于构建个体化疾病模型及精准药物筛选平台，但需同步突破传代极限并完善伦理规范。
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