ELISA外源性干扰物质会影响抗体和抗原结合，导致分析物浓度假高或假低，从而导致结果不准确。这些干扰物质非目标分析物，可能来自各种外源，例如样品处理不当，或存在于患者血液中，例如脂质、胆红素或血红蛋白。了解这些干扰因素对于准确的诊断和治疗至关重要。
标本溶血
血红蛋白中的血红素基因有类似过氧化的活性，如果以辣根过氧化物酶（HRP）为标记酶的酶联免疫吸附实验（ELISA）中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，其在温育过程就会被吸附在固相，从而在后面加入的HRP和底物反应显色和发光，导致假阳性结果。
如何避免这种影响
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保证样本质量：这是最重要的一步。在采集和处理血液样本时，要尽量轻柔，避免剧烈震荡或反复冻融，以防止溶血。离心得到的血清或血浆应该是清澈淡黄色的，而不是粉红色或红色。
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充分洗涤：ELISA实验中的洗涤步骤至关重要。充分的洗涤可以洗掉未结合的物质，包括那些非特异性吸附在孔板上的血红蛋白，从而降低背景信号。
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设置合适的对照：设置不加一抗或二抗的空白对照孔，如果这些孔也出现了明显的颜色，则很可能是由样本中的内源性类过氧化物酶（如血红蛋白）活性引起的。
样本被细菌污染
如果样本被细菌污染，这些细菌可能含有内源性的过氧化物酶/过氧化氢酶就会成为一个严重的干扰源，在ELISA实验中产生非特异性显色，进而干扰测定结果，造成假阳性。
如何避免这种影响：
在加入HRP标记的抗体之前，用3%的过氧化氢(H₂O₂)溶液处理样本/固相载体（如ELISA板、IHC切片）10-15分钟，然后用缓冲液（如PBS或PBST）彻底洗涤。
样本保存不当
如果样本保存不当，血清中IgG可聚合成多聚体、AFP可形成二聚体。在ELISA实验中，尤其是间接ELISA法，IgG聚合体和内源性酶会导致本底过深，AFP二聚体会导致结果偏低。
如何避免这种影响：
样本保存合适的温度，避免样本反复冻融，在进行ELISA实验可以做对照
标本凝集不全
在进行临床实验中，血液还未开始凝固时候强行离心分离血清，此时血清仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA检测中容易造成假阳性结果。
如何避免这种影响：
血液样本收集后，应在室温下静置一段时间（例如30-60分钟），待其完全凝固后，再通过离心分离上清，即可获得血清。
样本管中添加物质
抗凝剂（如肝素、EDTA）、酶抑制剂（如NaN3）及快速分离血清的分离胶等均对ELISA测定有一定干扰作用。例如，肝素抗凝血浆会增加OD值，EDTA、NaN3可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性，从而影响检测结果，可能导致假阴性。
如何避免这种影响：
遵循说明选对样，规避干扰做好验证。
样本中存在的内源性及外源性干扰物质，对ELISA实验结果的准确性具有决定性影响，甚至可以使整个实验功亏一篑。因此，透彻理解这些干扰因素的作用机制，是避免出现假阳性、假阴性等各种错误结果，确保数据真实可靠的根本前提。
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