RT-PCR:逆转录聚合酶链式反应

  逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）是一种分子技术。聚合酶联式反应（PCR）是一种实验方法，用于扩增DNA特定区域，以便在医学研究中进行分析和诊断。RT-PCR使用mRNA作为起始模板，是PCR的改良版。其中使用一种称为逆转录酶的酶。这种酶有助于将RNA序列转化为其互补DNA序列。RT-PCR就是基于逆转录的原理。它是一种实时技术，结合了RNA逆转录成DNA和靶DNA扩增。它是一种定性检测特定RNA序列的方法，具有很高的准确性和灵敏度。

  凯瑞·穆利斯(KarryMullis)发现了RT-PCR，以促进RNA检测和量化。他因发明该技术并彻底改变了分子生物学领域而获得了1993年诺贝尔化学奖。

  RT-PCR原理及步骤

  RT-PCR是一种分子诊断工具，其工作原理是利用逆转录酶将RNA模板转化为互补DNA(cDNA)。然后，该cDNA通过PCR进行指数扩增，形成多个副本，然后用于下游分析。

  典型的PCR以DNA为模板，所用的酶为Taq聚合酶。然而，为了扩增RNA，需要进行逆转录，因为RNA不是Taq聚合酶的有效模板。因此，改良版PCR增加了一个额外的步骤，即先将RNA转化为DNA，然后再进行PCR。

  首先，典型的RT-PCR检测需要核酸、引物、逆转录酶、RNA样本、DNA聚合酶和RT-PCR缓冲液。让我们详细了解一下RT-PCR过程：

  1.RNA分离完成后，提取RNA。

  2.将提取的RNA样本加入到反应混合物中。反应混合物由核苷酸、逆转录酶和针对目标基因的特异性引物组成。

  3.如果目标存在，引物将与提取的RNA退火。

  4.逆转录酶发挥合成互补DNA（cDNA）链的功能。

  RNA/DNA杂交现在经历PCR步骤：

  1.变性：在95oC时RNA/DNA链变性。

  2.退火：引物退火至新形成的cDNA

  3.延伸：从引物延伸，聚合酶通过复制合成新的DNA链。

  4.热循环仪中的多次循环会增加PCR产物中DNA的拷贝数。

  此外，RT-PCR可以通过两种不同的方式进行：

  一步法RT-PCR

  该方法中，逆转录和聚合酶链式反应的反应管是相同的，两个过程同时进行。这种简单方便的一步法适用于进行少量的检测。由于两个反应都在一个反应管中进行，因此使用的引物是序列特异性的。

  1.优点：

•   快速设置
•   处理时间更短
•   污染几率极小
•   易于加工

  2.缺点：

•   单独优化两个反应存在局限性
•   不太敏感
•   为了分析新靶标或重复扩增，需要保存RNA等分试样

  2步RT-PCR

  在该PCR反应中，RNA到cDNA的逆转录最初在40oC至50oC之间进行。随后，所得的cDNA在单独的反应中进行扩增-cDNA合成和PCR扩增是分离的。

  每一步使用的反应容器、缓冲液、试剂、条件和引发策略都不同。与一步RT-PCR不同，两步RT-PCR使用随机六聚体、基因特异性引物和寡聚dT引物的混合物。这允许获得更高产量的cDNA，这些cDNA可以储存或进一步扩增。

  这是一种高度敏感但耗时的方法。

  1.优点：

•   RT引物可供选择
•   可以从单个RNA源扩增多个目标
•   即使起始材料有限也可以进行
•   反应优化灵活
•   逆转录酶和DNA聚合酶可单独选择，灵活性更高

  2.缺点：

•   更多的机器时间和设置
•   需要更多优化
•   增加污染的可能性

  RT-PCR应用

  RT-PCR可应用于：

1.   基因组测序
3.   检测基因或染色体的变化
5.   基因表征
7.   基因表达和突变的研究
9.   RNA病毒研究
11.   白血病等疾病的诊断
13.   感染监测。

  RT-PCR在RNA病毒SARS-CoV-2的诊断中发挥了巨大作用。它成为检测特定RNA序列的基准技术，正是由于这种灵敏的体外方法，冠状病毒的大规模诊断才成为可能。