ELISA试剂盒实验常见问题盘点

  在进行ELISA实验过程中也会经常遇到一些问题，这些问题会阻碍我们实验进程，了解ELISA实验常见问题有助于提高实验的效率，上海纪宁为大家整理了ELISA试剂盒常见的问题

  Elisa常见问题

  1.样品如何保存？

  我们始终建议尽可能使用新鲜样品（通常这些样品会产生最佳结果）。或者，样品可以储存在–20°C、–80°C或液氮中（取决于样品）。

  2.是否可以使用试剂盒说明书中未推荐的样本类型？

  大多数情况下是的，只要预期浓度在试剂盒的范围内（理想情况下应该是中间范围）。需要注意的是，说明书中提到的样品类型已经过验证，并确认在指定条件下有效。其他样品类型尚未经过测试，因此无法保证它们是否有效。

  3.试剂盒的保存温度是多少？

  试剂盒的推荐储存温度通常为2-8°C。但是，试剂盒中的某些试剂可能需要在-20°C下储存。务必按照说明书对所有试剂正确储存条件，这将确保试剂盒发挥最佳性能。

  4.必须遵循ELISA说明书进行实验吗？

  试剂盒都经过精心优化，随意更改其中的参数（例如孵育时间、温度、试剂浓度等）都会影响抗原抗体反应、显色反应等，最终影响实验结果。

  5、其它试剂可以应用本试剂盒实验吗？

  ELISA试剂盒是一个经过精心匹配和优化的系统，各个组分之间相互协调才能保证实验的准确性和可靠性。除非试剂盒说明书明确允许使用某些替代试剂，否则强烈建议使用试剂盒提供的全部组分，以确保实验结果的准确性和可靠性。

  6.可使用的样品量和浓度是多少？

  样品体积通常在50-100μl之间，但这可能因检测而异。建议将样品稀释至试剂盒的中间范围，以获得最佳结果。此外，请注意，接近范围下限的低浓度可能无法准确检测，因为已知ELISA检测的范围会随着时间的推移而丢失，或者如果试剂盒没有适当保存。请勿改变说明书中推荐的样品体积，因为这些体积是为实现最佳性能而设计的。相反，建议使用更稀释或更浓缩的样品。

  7.如何处理产生的值超出分析动态范围的样本？

  产生的值高于最高标准的样本需要使用更高的稀释倍数重复。对于低于检测范围的样本值，这些值被视为不可检测。标准曲线范围之外的值通常是非线性的，由于此特性，无法使用此曲线正确推断出值。我们建议仅使用在检测动态范围内的样本值。

  8.是否需要同时运行所有样本？

  不是，因为大多数试剂盒都使用条状微孔板，因此每次只能使用单个条状微孔板，可用于在不同时间分析不同数量的样品。

  9.每次都要进行空白和标准检测吗？

  是的，因为这些值是计算样品浓度和再现性所必需的。这很重要，因为它可以反映出每次测定和每天的性能变化。

  10.是否需要运行重复样本和标准？

  是的，这对于监测检测的精确度很重要，并能提高检测结果的可信度。我们建议至少进行重复实验，但最好进行三次（或更多）。

  11.如何获得可重复的结果？

  孵育时间、温度、操作者、所用清洗和移液技术以及试剂盒使用年限的任何变化都可能导致产生许多差异。这些会直接影响所获得的结果，因此强烈建议每个用户都获得自己的标准曲线。

  12.标准工作正常，但没有样品信号？

  这可能由多种原因造成。简单的事实可能是样品可能不包含您认为正在测试的分析物。未正确遵循建议的稀释度，样品过度稀释可能导致其低于标准曲线的范围，从而无法检测到。也可能存在基质效应，这可能会掩盖检测。

  13.什么是样品基质效应？

  大多数生物样本由多种不同蛋白质和盐的复杂混合物组成。众所周知，这些溶解成分的存在会降低抗原和抗体的结合能力。这导致建立终点结合或平衡条件所需的时间大大增加。由于样本中存在IgG的非特异性结合相互作用，也会产生假信号。样本稀释缓冲液的配方可用于降低与基质效应相关的测定背景噪音，并最大限度地减少IgG的非特异性结合，从而有助于优化测定信号。仅出于这个原因，许多样本可能需要稀释才能落入测定的功能范围内。

  14.需要使用 ？

  强烈推荐这种方法，因为众所周知，与使用振荡器相比，获得的OD值通常要低得多。

  15.建议按照哪些流程进行清洗步骤？

  手动和自动清洗程序都是可行的选择。我们建议定期进行校准，并在清洗前冲洗系统。还必须小心吸干板子时使用的所有内容物和无绒纸。

  16.如果已经提取了样本，建议的稀释度是多少？

  在这种情况下，建议不要遵循试剂盒手册中推荐的稀释度，因为提取程序后所需的样品稀释量将受到提取和纯化步骤的影响。浓缩或稀释的量需要由最终用户决定。

  17.波长校正是如何进行的？

  板读取器必须设置为450nm，如果波长校正可用，则需要将其设置为540nm或570nm。此减法将纠正板中可能存在的任何光学缺陷。但是，如果读取器中没有此功能，则需要从450nm的读数中减去540nm或570nm的读数。进行双波长读数的主要原因是为了校正可能由塑料孔、灯或任何其他光学波动引起的光密度。如果仅直接在450nm下读数而不进行任何校正，则可能导致获得的结果更高且更不准确。

  18.造成背景信号过高的主要原因有哪些？

  主要原因是底物被污染，含有氧化剂或金属离子。清洗不当是另一个众所周知的原因，检查清洗缓冲液储液器的容量并严格遵循协议说明书中提到的推荐清洗程序至关重要。将底物暴露在光线下会导致底物变成其测量的蓝色，这也会导致高背景信号。

  上述是纪宁为大家总结ELISA常见的问题，了解这些问题可以使自己再日后的实验中提高实验的效率。