ELISA试剂盒常见的技术类型详解：间接法、夹心法和竞争法

  实验实验常用的elisa试剂盒在科研中常用于测量生物样本中抗原、抗体、肽、蛋白质、激素或其他生物分子的存在和/或浓度。它非常灵敏，能够检测出低浓度的抗原。ELISA的灵敏度归因于它能够检测单个抗原-抗体复合物之间的相互作用。除此之外，加入酶偶联抗原特异性抗体可以将无色底物转化为显色或荧光产物，这些产物可以通过酶标仪检测和轻松定量。当与已知抗原滴定量产生的值进行比较时，可以确定实验样本中相同抗原的浓度。

  虽然不同的科研人员可能使用不同的ELISA试剂盒方案来测量样本中的抗原浓度，但这些方案都基于相同的原理。选择要执行的ELISA类型（间接、夹心或竞争）取决于许多因素，包括要测试的样本的复杂性和可用的抗原特异性抗体。间接ELISA常用于确定免疫反应的结果，例如测量样本中抗体的浓度。夹心ELISA最适合分析复杂样本，例如组织培养上清液或组织裂解物，其中分析物或目标抗原是混合样本的一部分。最后，当只有一种抗体可用于检测目标抗原时，最常使用竞争性ELISA。竞争性ELISA还可用于检测只有一个抗体表位的小抗原，由于空间位阻，这种抗原无法容纳两种不同的抗体。接下来上海纪宁生物为大家详细描述一下ELISA试剂盒检测方法及实验步骤。

  间接ELISA法及实验步骤

  间接ELISA检测通常用于测量血清或杂交瘤培养上清液中的抗体量。间接ELISA检测的一般步骤如下：

  用抗原包被孔

  加入含有抗体（一抗或1°抗体）的血清或杂交瘤培养上清液

  孵育并清洗

  添加二抗（或2°）酶联抗体

  孵育并清洗

  添加底物

  夹心ELISA法及实验步骤

  夹心ELISA检测不同于间接ELISA检测，因为该方法不涉及用纯化的抗原包被板。相反，使用“捕获”抗体包被板的孔。抗原“夹”在捕获抗体和第二个“检测”酶偶联抗体之间——其中两种抗体对同一抗原具有特异性，但针对不同的表位。通过与捕获抗体/抗原复合物结合，检测抗体保留在板中。单克隆抗体或多克隆抗血清可用作捕获和检测抗体。夹心ELISA的主要优点是分析前无需纯化样品。此外，该检测非常灵敏。许多市售ELISA试剂盒都是夹心类型，使用经过测试的匹配抗体对。夹心ELISA检测的一般程序是：

  用捕获抗体包被孔

  添加含有抗原的测试样本

  孵育并清洗

  添加酶联检测抗体。

  孵育并清洗

  添加底物

  大多数市售的夹心ELISA试剂盒都配有酶偶联检测抗体。如果没有酶偶联检测抗体，可以使用针对检测抗体的特异性二抗。二抗上的酶起着相同的作用，即将无色底物转化为显色或荧光产物。例如，上述二抗更倾向于在由已经生成自己的单克隆抗体的研究人员开发的“自制”夹心ELISA中使用。使用二抗的一个缺点是要确保它只与检测抗体结合，而不是与结合到板上的捕获抗体结合。这将导致所有孔中都有可测量的产物，无论是否存在抗原或检测抗体。

  竞争ELISA法及实验步骤

  最后，使用竞争性ELISA检测可溶性抗原。该方法操作简单，但仅适用于纯化抗原量较大时。竞争性ELISA检测的一般程序为：

  用抗原包被孔

  孵育并清洗

  将测试样品与酶偶联的一抗预孵育

  将混合物加入

  孵育并洗去任何未结合的酶偶联一抗

  添加底物

  本测定中的“竞争”源自于这样的事实：步骤3中使用的测试样品中的抗原越多，可与孔中包被的抗原结合的抗体就越少。因此，测定结束时孔中显色/荧光产物的强度与测试样品中存在的抗原量成反比。

  任何类型的ELISA中的关键组成部分都是已知浓度的滴定标准，它使用户能够确定测试样本中存在的抗原浓度。通常，会指定一系列孔来创建标准曲线，其中将已知量的纯化重组蛋白以递减的量添加到孔中。当这些孔与测试样本同时处理时，用户可以从微孔板读数器获得一组已知蛋白质浓度的参考吸光度值，以配合测试样本的吸光度值。然后，用户可以计算出标准曲线，将测试样本与该标准曲线进行比较，以确定存在的目标蛋白质量。标准曲线还可以确定用户稀释的精确度。

  最后，上述每种ELISA类型的最后一步都需要添加底物。底物转化为产物的程度与孔中存在的酶量直接相关。辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)是与抗体结合的最常见酶。正如预期的那样，有许多底物可用于产生显色或荧光产物的酶。此外，底物的灵敏度范围很广，可以提高检测的整体灵敏度。在选择要使用的底物类型及其相应的酶结合抗体时，用户还必须考虑实验结束时可用于读取板的仪器类型。

  HRP常用的显色底物包括2,2'-联氮双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐(ABTS)和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，而AP则使用对硝基苯基磷酸酯(PNPP)。ABTS和TMB分别产生水溶性绿色和蓝色反应产物。绿色ABTS产物有两个主要吸光度峰，分别为410和650nm，而蓝色TMB产物在370和652nm处检测效果最佳。加入酸性终止液后，ABTS和TMB的颜色会变成黄色，最佳读数为450nm。ABTS显色速度慢，而TMB显色速度快。TMB比ABTS更灵敏，如果酶促反应进行时间过长，可能会产生更高的背景信号。PNPP经AP转化后生成黄色水溶性产物，在405nm处吸收光。