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纪宁生物辅酶ⅡNADP(H)含量试剂盒测定原理

纪宁生物辅酶ⅡNADP(H)含量试剂盒测定原理
辅酶ⅡNADP(H)含量试剂盒
注 意:正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:
辅酶ⅡNADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,NADP+和 NADPH 含量测定可以计算 NADP(NADPH + NADP+)含量和 NADPH/NADP+比值,其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一,而且在 PPP 途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。
测定原理:
分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NADP+和 NADPH。NADPH 通过 PMS 的递氢作用,使氧化型噻唑蓝(MTT)还原为甲瓒,570nm 下检测吸光值,从而测定 NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原 NADP+
为 NADPH,从而检测 NADP+含量。
所需的仪器和用品:
酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
NADP+和 NADPH 的提取:
1 血清(浆)中 NADP+和 NADPH 的提取
NADP+的提取:按照血清(浆)体积(mL):酸性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1mL血清(浆),加入 1mL 酸性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
NADPH 的提取:按照血清(浆)体积(mL):碱性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1mL血清(浆),加入 1mL 碱性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2 组织中 NADP+和 NADPH 的提取:
NADP+的提取:按照组织质量(g):酸性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1g 组织,加入1mL 酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
NADPH 的提取:按照组织质量(g):碱性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1g 组织,加
入 1mL 碱性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃
离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,
置冰上待测。
3 细胞或细菌中 NADP+和 NADPH 的提取:
NADP+的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104 个):酸性提取液体积
(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液),超声波破碎(冰浴,功率
20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,
10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心
10min,取上清,置冰上待测。
NADPH 的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104个):碱性提取液体积
(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液),超声波破碎(冰浴,功率
20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,
10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心
10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤:
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 570nm,蒸馏水调零。
2、 加样表(在 1.5mL 棕色 EP 管中按下表依次加样):
混匀,取 200μL 转移至微量石英比色皿或 96 孔板中,570nm 下读取对照吸光值 A1 和测定管吸光值 A2,计算△A=A2-A1。
注意事项:
1、如果一次性测定样本数较多,可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。
2、对照管和测定管的测定步骤的区别:对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六;测定管
加完试剂一、二、三、四和五后必须反应 20min 后再加试剂六。
3、反应过程中注意避光。
4、若 NADP+测定中△A(A2-A1)≤0.0144,NADPH 测定中△A(A2-A1)≤0.0259,说明样本中辅酶含量较低,已低于检测限,可做如下调整:
(1)将测定管避光静置时间20min延长到60min;
(2)在提取
阶段增加取样量,即取 0.2g样本或 0.2mL 样本加入 1mL 提取液。
5、由于每一个测定管需要设一个对照管,本试剂盒 100 管保证测 48个NADP+或 NADPH.
NADP+和 NADPH 含量的计算:
(一)NADP+含量的计算
标准条件下的回归曲线为 y = 0.0985x + 0.0144,R2 = 0.9998;其中 y 为△A,x 为 NADP+浓度 nmol/mL
1、血清(浆)中 NADP+含量计算
NADP+含量(nmol/mL)=[ (△A -0.0144)÷0.0985×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 203×(△A -0.0144)
2、组织、细菌或细胞中 NADP+含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NADP+
(nmol/mg prot)=[(△A -0.0144)÷0.0985×V1) ]÷(V1×Cpr)= 10.2×(△A -0.0144)÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
NADP+
(nmol/g 鲜重)= [(△A -0.0144)÷0.0985×V1)] ÷(W×V1÷V2)=20.3×(△A -0.0144)÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
NADP+
(nmol/10⁴ cell)=[(△A -0.0144)÷0.0985×V1)] ÷(500×V1÷V2)=0.04×(△A -0.0144)
(二)NADPH 含量的计算
标准条件下的回归曲线为 y = 0.6198x + 0.0259,R2 = 0.9977;其中 y 为△A,x 为 NADPH浓度nmol/mL
1、血清(浆)中 NADPH 含量计算
NADPH 含量(nmol/mL)= [(△A -0.0259)÷0.6198×V1)] ÷(V3×V1÷V2)= 32.3× (△A -0.0259)
2、组织、细菌或细胞中 NADPH 含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NADPH (nmol/mg prot)=[ (△A -0.0259)÷0.6198×V1)] ÷(V1×Cpr)= 1.6× (△A -0.0259)÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
NADPH (nmol/g 鲜重)=[(△A -0.0259)÷0.6198×V1) ]÷(W×V1÷V2)=3.2× (△A -0.0259)÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
NADPH (nmol/10⁴ cell)=[(△A -0.0259)÷0.6198×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.006× (△A -0.0259)V1:加入反应体系中样本体积,0.02mL;V2:加入提取液体积,2mL;V3:加入血清(浆)体积:
0.1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL; W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。
注 意:最低检测限为 0.01nmol/mL 或 0.01nmol/g 鲜重 或 0.001nmol/mg prot
上海纪宁生物一直致力于为广大高校、科研院所和企事业单位提供辅酶ⅡNADP(H)含量试剂盒的科研试剂和完善的技术服务,满足生物化学、分子生物学、细胞生物学、免疫学等生物科技实验需求。
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