ELISA试剂盒：如何制备ELISA样品

  酶联免疫吸附实验（ELISA）有助于量化给定样本中存在的目标量。在进行ELISA实验，样本制备是非常重要的，这也觉得实验成功的关键。

  样本制备完成后，可以分装并冷冻以便长期保存。建议的储存条件如下：2-8°C保存5天，-20°C保存6个月，-80°C保存2年。还建议在从存储中取出样本时避免反复冻融循环，因此最好将样本分装到较小的份量中保存。

  有许多不同的样本可用于ELISA方法。下面将讨论一些最常见的样本，并提供有关如何最好地制备每种样本的一般说明。但是，我们建议遵循每个试剂盒提供的具体说明，因为不同试剂盒的方案可能会略有不同。

  不同的样本类型

  血清样本

  血清：不含任何血细胞或凝血因子；它就像没有纤维蛋白原的血浆。

  （a）使用含有促凝剂的血清分离管采集全血样本。将血液样本在室温下静置30-60分钟以使其凝固，然后在4°C下放置1-2小时（或2-8°C过夜）以促进完全凝固。

  （b）之后，将样品以1000xg（例如，使用半径为10cm的离心机，转速约为2500rpm）离心20分钟。

  （c）小心地将上清液（血清）转移到干净的试管中，避免吸取到下层血细胞和凝块。血清可以立即用于分析，或在-20°C或-80°C下冷冻保存以备后用。

  血浆样本

  血浆需要使用抗凝剂，具体选择取决于目标分析物。常用的抗凝剂包括EDTA（常用于血液学检测）、柠檬酸钠（常用于凝血功能检测）和肝素（常用于生化检测）。

  (a)将血液收集到含有相应抗凝剂的试管中，立即轻轻颠倒试管5-10次，确保血液与抗凝剂充分混合。

  (b)建议在收集样品后尽快离心，最好在30分钟内，具体时间取决于目标分析物。在2-8°C下以1000xg（例如，使用半径为10cm的离心机，转速约为2500rpm）离心样品15分钟。

  (c)小心地将上清液（血浆）转移到干净的试管中，避免吸取到下层血细胞。

  (d)血浆可以立即用于分析，也可以在-20°C或-80°C下冷冻保存以备后用。避免反复冻融。

  组织样本

  几乎所有的组织样本都需要进行匀浆处理，具体方案取决于所提取的组织和目标分析物。为了防止蛋白水解和其他降解过程，通常需要添加适当的蛋白酶抑制剂和其他抑制剂。

  (a)使用无菌的不锈钢解剖工具解剖组织，并迅速置于冰上以抑制酶活性。

  (b)使用预冷的0.01MPBS缓冲液（pH7.4）轻轻洗涤组织三次，以尽可能去除残留血液。

  (c)称重组织，然后将其切碎或剪碎。将组织加入适量的匀浆缓冲液（根据目标分析物和组织类型选择）中，使用合适的匀浆器（例如，组织研磨器、超声波破碎仪等）进行匀浆。建议记录组织与匀浆缓冲液的比例。

  (d)将处理后的匀浆以5000xg（例如，使用半径为10cm的离心机，转速约为6000rpm）离心5分钟。

  (e)小心地将上清液转移到干净的试管中。

  (f)上清液可以立即用于分析，也可以在-20°C或-80°C下冷冻保存以备后用。避免反复冻融。

  一些组织样本，例如肾脏、肝脏、胰腺和脑组织，含有内源性生物素，可能与亲和素和链霉亲和素相互作用，导致假阳性结果。在分析这些组织样本时，需要考虑生物素干扰的可能性，并采取相应的措施。

  细胞样本

  为了进行ELISA分析，首先需要裂解细胞以释放目标蛋白。裂解方法可以是化学方法（例如使用TritonX-100、脱氧胆酸钠、RIPA、SDS、DTT和尿素等试剂）或物理方法（例如反复冻融循环或超声处理）。选择哪种方法取决于目标蛋白和下游应用，需要根据具体情况进行优化。

  (a)对于贴壁细胞，使用胰蛋白酶消化细胞，然后离心收集细胞沉淀，弃去上清液。对于悬浮细胞，直接离心收集细胞沉淀，弃去上清培养基。离心力及时间需根据细胞类型进行优化。

  (b)将细胞沉淀重悬于预冷的PBS中，离心洗涤三次，以去除残留的培养基和杂质。

  (c)使用合适的裂解方法裂解细胞。例如，加入预冷的RIPA裂解液（具体配方...），冰上孵育一段时间（例如30分钟），并进行涡旋振荡。或者，进行四次冻融循环（将样品置于液氮中快速冷冻，然后在37°C水浴中快速解冻）。或者，使用超声波破碎仪进行超声处理（具体参数...）。

  (d)以1500xg（例如，使用半径为10cm的离心机，转速约为3500rpm）离心10分钟，以去除细胞碎片。

  (e)小心地将上清液（细胞裂解物）转移到干净的试管中。

  (f)细胞裂解物可以立即用于分析，也可以在-20°C或-80°C下冷冻保存以备后用。避免反复冻融。

  细胞培养上清液

  当目标分析物是分泌蛋白时，可以使用细胞培养上清液进行ELISA检测。

  (a)以1000xg（例如，使用半径为10cm的离心机，转速约为2500rpm）离心20分钟，以去除细胞碎片和沉淀物。

  (b)小心地将上清液转移到干净的试管中。

  (c)细胞培养上清液可以立即用于分析，也可以在-20°C或-80°C下冷冻保存以备后用。避免反复冻融。

  痰液样本

  痰液是由呼吸道分泌的粘液，其中可能包含唾液、细胞碎片、细菌、炎症细胞等。痰液样本常用于检测呼吸道感染的病原体。

  (a)收集新鲜的痰液样本到无菌容器中。记录痰液样本的体积。

  (b)向痰液样本中加入等体积的0.1%DTT溶液（DTT用于溶解痰液），并在37°C水浴中孵育5分钟，并定期轻轻混匀。

  (c)使用1xPBS将DTT-痰液混合物稀释至1/2的浓度，并在室温下继续轻轻混匀15-20分钟。

  (d)使用孔径为XXμm的金属丝网过滤混合物，以去除较大的杂质和粘液块。

  (e)以1500xg（例如，使用半径为10cm的离心机，转速约为3500rpm）离心10分钟，使细胞碎片和细菌沉淀。

  (f)小心地将上清液转移到干净的试管中。

  (g)上清液可以立即用于分析，也可以在-20°C或-80°C下冷冻保存以备后用。避免反复冻融。

  脑脊液、腹水和支气管肺泡灌洗液(BALF)样本

  脑脊液、腹水和支气管肺泡灌洗液(BALF)等体液样本的处理方法略有不同，需要根据具体情况进行调整。以下是一些通用的指导原则：

  （a）脑脊液：

  收集新鲜的脑脊液样本到无菌容器中。

  以400xg(例如，使用半径为10cm的离心机，转速约为1800rpm)离心10分钟，以去除细胞。

  小心地将上清液转移到干净的试管中，避免扰动沉淀。

  上清液可以立即用于分析，也可以在-20°C或-80°C下冷冻保存以备后用。避免反复冻融。细胞沉淀可以根据需要进行进一步分析。

  （b）腹水：

  收集新鲜的腹水样本到无菌容器中。

  以1000xg(例如，使用半径为10cm的离心机，转速约为2500rpm)离心10分钟，以去除细胞和杂质。

  小心地将上清液转移到干净的试管中，避免扰动沉淀。

  上清液可以立即用于分析，也可以在-20°C或-80°C下冷冻保存以备后用。避免反复冻融。细胞沉淀可以根据需要进行进一步分析。

  （c）支气管肺泡灌洗液(BALF)：

  收集新鲜的BALF样本到无菌容器中。

  可选步骤：使用无菌纱布或细胞滤网过滤BALF，以去除粘液和大的组织碎片。

  以450xg(例如，使用半径为10cm的离心机，转速约为2000rpm)离心10分钟，以去除细胞和杂质。

  小心地将上清液转移到干净的试管中，避免扰动沉淀。

  上清液可以立即用于分析，也可以在-20°C或-80°C下冷冻保存以备后用。避免反复冻融。细胞沉淀可以根据需要进行细胞计数、分类和进一步分析。

  友情提示：以上只是一些通用的指导原则，具体的操作步骤和参数需要根据实验目的和样本类型进行优化。建议查阅相关文献或咨询专业人士，以确定最佳的处理方法。始终保持无菌操作，以防止样本污染。

  上述是纪宁为大家介绍在进行ELISA实验时候，常见的样本制备的方法，样本制备好坏对ELISA实验影响非常大，正确的进行样本制备可以提高实验效果。