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纪宁生物甲醛脱氢酶(FDH)测试盒测定原理

纪宁生物甲醛脱氢酶(FDH)测试盒测定原理
甲醛脱氢酶(FDH)测试盒

注 意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
甲醛是一种能与蛋白质、核酸和脂类产生非特异性反应的活泼化合物,对所有生物都具有很高毒性。甲醛
脱氢酶作为含锌中等链醇脱氢酶(ADH)的家庭成员之一,广泛存在于原核和真核生物中,该酶能利用 NAD+
作为辅酶,将有毒的甲醛氧化,是甲醛氧化途径中的关键酶。
测定原理:
甲醛脱氢酶催化甲醛和 NAD+产生 NADH,在 340nm 处的吸光值会增加,测定 340nm 处的吸光值变化,可
计算得到甲醛脱氢酶的活性。
自备实验用品及仪器:
天平、离心机、分光光度计、1mL 玻璃比色皿、蒸馏水。
试剂组成和配制:
提取液:液体 60mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 30mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:粉剂×1 瓶,-20℃保存;临用前加入 15mL 水溶解待用,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复
冻融。
试剂三:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入 3mL 水溶解待用。
试剂四:液体 3mL×1 瓶,4℃避光保存。
FDH 提取:
1. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提
取液)进行冰浴匀浆,然后 10000g,4℃,离心 20min。
2. 细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL
提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 10000g,
4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
3. 液体:直接检测。
测定操作表:
1、 分光光度计预热 30min,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2、 操作表
在比色皿中加入如下试剂
测定管
样本(µL) 100
试剂一(µL) 550
试剂二(µL) 250
试剂三(µL) 50
试剂四(µL) 50
混匀,于 340nm 下测定初始吸光值 A1 与 5min 后的吸光值 A2,△A=A2-A1。
若样本数量较多,可将试剂按比例配成工作液使用。
FDH 酶活计算:
(1)按蛋白浓度计算
酶活定义:每毫克蛋白每分钟催化还原 1nmol NAD+的酶量为 1 个酶活单位。
FDH 酶活(nmol/min/mg prot)= ×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T = 322×△A÷Cpr
(2)按样本质量计算
酶活定义:每克样品每分钟催化还原 1nmol NAD+的酶量为 1 个酶活单位。
FDH 酶活(nmol/min/g 鲜重)= ×V 反总÷(V 样×W÷V 样总)÷T =322×△A÷W
(3)按照细胞数量计算
酶活定义:每 10⁴个细胞每分钟催化还原 1nmol NAD+的酶量为 1 个酶活单位。
FDH 酶活(nmol/min/10⁴cell)= ×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量(万个))÷T= 322×△A÷细胞数量
(4)按液体体积计算
酶活定义:每 mL 样本每分钟催化还原 1nmol NAD+的酶量为 1 个酶活单位。
FDH 酶活(nmol/min/mL)= ×V 反总÷V 样÷T=322×△A
:NADH 微摩尔消光系数,6.22×10-3 L/µmol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 反总:反应体系总体积,
1mL;V 样:反应体系中样本体积,0.1mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T,反应时间,5min;Cpr:样
本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g
上海纪宁生物一直致力于为广大高校、科研院所和企事业单位提供的甲醛脱氢酶(FDH)测试盒科研试剂和完善的技术服务,满足生物化学、分子生物学、细胞生物学、免疫学等生物科技实验需求。
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